ECi-basierte Gewebsklärung

Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (Zimtsäureethylester, ECi) ist ein organisches Lösungsmittel mit einem refraktären Index von 1,558. ECi ist ein von der Food and Drug Administration und der European directive 67/548/EWG zugelassener Lebensmittelaromastoff und Zusatz für kosmetische Produkte. Gemäß dessen ist ECi nicht toxisch und kann ohne besondere Sicherheitsmaßnahmen genutzt werden. (Originalpublikation: Klingberg et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.)

Häufig gestellte Fragen (FAQ), die ECi-basiertes Clearing betreffen

Hier sammeln wir die häufig gestellten Fragen (FAQ), die uns von Wissenschaftler erreichen, die mit ECi arbeiten um ihre Proben zu clearen. Falls Sie eine Frage zum ECi-basierten Clearing haben sollten, können Sie sich gerne an Prof. Dr. Matthias Gunzer wenden.

1. Generelle Fragen zum ECi Clearing

  • Q: Wie werden die geclearten Proben aufgewahrt?
    ECi-geclearte Proben sollten in ECi bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt werden. ECi gefriert bei 6-8°C, weswegen Sie Ihre Proben nicht im Kühlschrank aufbewahren sollten! Zudem sollten Sie beachten, dass ECi nicht mit Polystyrolgefäßen kompatibel ist. Nutzen Sie Polypropylen- oder Glasgefäßen um Proben in ECi zu lagern. Des Weiteren ist die optische Klärung ein reversibler Effekt. Wenn Sie Ihre Proben zurück in EtOH Lösungen überführen, werden sie wieder undurchsichtig.

2. Dehydrierung (Pre-Clearing)

  • Q: Muss ich EtOH für die Gewebsdehydrierung verwenden, um ECi nutzen zu können?
    Nein, Sie können alles (THF, MeOH) nutzen, solange es das Wasser ausreichend aus der Probe entfernt. Sie können Ihre Probe sogar gemäß Ihrer Standardprozedur, z.B. in DBE, clearen und dann in ECi für das Imaging überführen. Beachten Sie jedoch, dass der refraktäre Index passt, nachdem Ihr Protokoll abgeschlossen ist!
  • Q: Wie passe ich den pH der Ethanolreihe an?
    Um den pH auf ein basisches Level (etwa 9,0) anzupassen, nutzen wir 0,1M NaOH und 0,1M HCl. Da der pH nur für Wasser-basierte Lösungen gilt, werden nur die pH Level der Wasser-beeinhaltenden EtOH Lösungen (50% EtOH und 70% EtOH, nicht 100% EtOH) angepasst. Für die pH Kalibrierung können sowohl Indikatorpapier als auch pH Elektroden verwendet werden.
  • Q: Ist der pH der Ethnaolreihe stabil? Brauche ich einen genauen pH von 9?
    Ja, der angepasste pH ist für einige Wochen stabil, falls die folgenden Aspekte berücksichtigt werden: Gemäß Le Chateliers Prinzip beeinflusst die Temperatur das pH Gleichgewicht massiv. Daher sollten alle Schritte der pH Anpassung und Gewebsdehydrierung bei einer konstanten Temperatur (4-8°C) durchgeführt werden. Das heißt, dass die Ethanollösung vor der pH Anpassung auf 4-8°C heruntergekühlt und dann bei derselben Temperatur aufbewahrt werden sollte. Des Weiteren sollte Aqua ad iniectabilia und kein destilliertes Wasser zur Generierung der 50% und 70% EtOH Lösungen genutzt werden. Destilliertes Wasser neigt dazu Kohlenstoffdioxid aus der Atmosphäre zu absorbieren und dadurch schnell auf einen sauren pH zu fallen.
    Nein, es ist nicht nötig den pH auf exakt 9,0 einzustellen. Andere basische pH Level (pH 8-11) stabilisieren die endogenen Fluoreszenzproteine ebenso.

3. Clearing mit ECi

  • Q: Könnten Sie mir sagen in welcher Konzentration ECi eingesetzt wird? Und worin es gelöst wird?
    ECi kann so verwendet werden, wie es vom Hersteller geliefert wird; als pure Flüssigkeit. Sie müssen ECi in nichts anderem auflösen. Beachten Sie jedoch, dass ECi im Kühlschrank gefriert!

4. Post-Processing

  • Q: Können geclearte Proben noch für histologische Analysen genutzt werden?
    Ja, können sie. Da Clearing ein reversibler Prozess ist, können Sie Ihre Proben rehydrieren und für die Histologie verwenden. Dafür wird ECi durch Inkubation in absteigendenen EtOH Lösungen (100 %, 70% und 50%), die ein permeabilisierendes Agens (Tween20/Triton X100) enthalten, aus dem Gewebe ausgewaschen. Nach der Rehydrierung können die Proben dann für Paraffin- und Cryoschnitte verwendet werden. Sowohl IHC als auch IF Färbungen funktionieren dann noch.

5. Organspezifische Fragen

  • Q: Kann ich Lipid-reiche Strukturen wie das Gehirn ebenfalls mit ECi clearen?
    Ja, können Sie. Während des Dehydrierungsprozesses müssen Sie dazu einen Delipidierungsschritt einfügen. Im publizierten Protokoll nutzen wir 2% Tween20, das dem Ethanol zugesetzt wurde. Sollte dies zu schwach für Sie sein, können Sie auch THF, Methanol or DCM, die alle hohe Delipidierungseigenschaften besitzen, nutzen. Beachten Sie jedoch die Toxizität dieser Reagenzien und gehen Sie vorsichtig mit ihnen um.
  • Q: Wie lang dauert es Knochengewebe zu clearen?
    4h PFA, 12h jeweils für 50%/70% und 2x 12 h in 100% Ethanol, 6h Clearing in ECi (Klingberg et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy., suppl. Table 2)
  • Q: Haben Sie Erfahrung mit dem Clearing von Knochen aus größeren Tieren, z.B. Minischweinen?
    Wir arbeiten nicht mit größeren Tieren. Im Prinzip sollte es möglich sein, jedoch wird das Clearing sehr viel länger dauern.
  • Q: Ist es möglich das Knochengewebe nach dem Clearing mit ECi mit fluoreszenten Antikörpern zu färben?
    Wir färben unsere Proben nach der Fixierung, aber vor der Dehydrierung (EtOH Reihe) und der Anpassung des refraktären Index (ECi). Es ist möglich, aber dauert länger. Alles, was Sie im lebenden Tier schon färben können, erspart Ihnen Zeit und produziert bessere Färbungen.
  • Q: Wurde für die Lungen die Agarose, mit der die Lungen aufgebläht wurden, wieder entfernt (wenn ja, wann?) oder wird diese im Gewebe gelassen?
    Die Agarose bleibt in den Lungen und wird zusammen mit der Probe dehydriert und gecleart.